Abstract

La formation de photoproduits dans l'ADN induite par les UV est un événement majeur dans le déclenchement du cancer de la peau. Par conséquent, de nombreux outils analytiques ont été développés pour quantifier ces photoproduits dans l'ADN. Dans cette étude, nous avons étendu notre méthode précédente de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à la quantification des courts fragments d'ADN contenant les photoproduits qui sont libérés des cellules par le mécanisme de réparation. Nous avons mis en place un protocole robuste comprenant une étape d'extraction en phase solide (SPE), un traitement enzymatique visant à libérer les photoproduits individuels, et une méthode de chromatographie liquide combinant une SPE en ligne et une chromatographie liquide à ultra-haute performance pour une spécificité et une sensibilité optimales. Nous avons également ajouté des étalons internes pertinents pour une meilleure précision. La méthode a été validée pour sa linéarité, sa reproductibilité et sa répétabilité. Les limites de détection et de quantification se situaient dans la gamme des fmol. La preuve du concept de l'utilisation des produits de réparation de l'ADN excrétés comme biomarqueurs de la génotoxicité des UV a été obtenue d'abord dans des études in vitro utilisant des cellules HaCat en culture, puis ex vivo sur des explants de peau humaine. Des preuves supplémentaires ont été obtenues par la détection de dimères de pyrimidine dans l'urine de volontaires humains collectée après une exposition récréative en été. Un dosage a été conçu pour quantifier les photoproduits de l'ADN libérés des cellules sous forme de courts fragments par le mécanisme de réparation de l'ADN. Ces oligonucléotides ont été isolés par extraction en phase solide et hydrolysés enzymatiquement. Les photoproduits ont ensuite été quantifiés par SPE en ligne combinée à UHPLC-MS/MS avec dilution isotopique.